Estudio comparativo de un PCR anidado, ELISA y AGID en la detección del virus de la leucosis bovina en muestras de suero, sangre y leche (página 2)

MATERIAL Y MÉTODOS

Obtención de las muestras biológicas y
procesamiento. Muestras de leche,
sangre y suero
fueron recolectadas desde 126 animales de un
predio de la Comuna de Freire, Temuco. Las muestras de leche (60
ml) se obtuvieron por ordeña manual en frascos
conteniendo dicromato de potasio (0,1% p/v) como preservante. Las
muestras de sangre se recolectaron en tubos Vacutainer de 7 ml
usando EDTA-potásico (1,5 mg/ml de sangre) como
anticoagulante, mientras que las muestras de suero se
recolectaron en tubos Vacutainer de 10 ml sin anticoagulante. Las
muestras de leche se descremaron mediante centrifugación
por 10 minutos a 3.500 r.p.m. y la fracción clarificada se
conservó a –20°C para su posterior análisis en nuestro laboratorio
mediante ELISA, mientras que la fracción de células
somáticas se utilizó para la extracción de
ADN.

Aislamiento de ADN. El pellet de células
somáticas correspondiente a 60 ml de leche se
utilizó para la extracción de ADN de acuerdo a un
protocolo
estándar que consistió en una lisis celular
(Tris-HCl, 10 mM pH 8,0; EDTA 1
mM, Proteinasa K 1 mg/ml y SDS 1%) e incubación a 55°C
durante toda la noche. Los restos celulares se precipitaron y
separaron mediante la adición de NaCl 6 M y
centrifugación a máxima velocidad por
10 minutos. El ADN se recuperó finalmente de la fase
acuosa mediante precipitación con etanol y se
resuspendió en tampón T.E. Para las muestras de
sangre se utilizó un procedimiento
similar adicionando una etapa preliminar de hemólisis de
los eritrocitos con una solución de NH4Cl al
0,85%.

Diagnóstico serológico. La
detección de anticuerpos al VLB en las muestras de leche y
suero se realizó mediante la técnica de
enzimoinmunoensayo indirecto (ELISAi) empleando un kit comercial
(SVANOVA, Suecia) de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
Las lecturas espectrofotométricas se realizaron en un
lector ELISA (Labsystems, Multiskan EX) a 450 nm y utilizando
para la interpretación de los resultados una
relación de densidad óptica
corregida (DO muestra/DO
control positivo)
igual o superior a 6% para las muestras de leche y 10% para las
muestras de suero. Una alícuota de las muestras de suero
fueron enviadas al Laboratorio del Complejo de Lo Aguirre del
SAG, para su análisis mediante el método
oficial de AGID.

Diagnóstico viral mediante PCR. El
virus se
detectó directamente desde ADN purificado de la
fracción de leucocitos de leche y sangre mediante un PCR
anidado empleando dos pares de partidores correspondientes a una
región altamente conservada del gen env viral
(Beier y col 2001).

La primera reacción se realizó en un
volumen final
de 30 ml conteniendo 20-100 ng de ADN, 0,2 mM de cada partidor
(F-TCTGTGCCAAGTCTCCCAGATA y R-AACAACAACCTCTGGGGAGGGT), 75 mM
dNTP, 3 ml de tampón PCR 10X, (Promega), 1,5 mM
MgCl2 y 0,75 U de Taq DNA Polimerasa.

En la segunda reacción se utilizó como
templado 3 ml del producto de la
primera amplificación y los partidores
F-CCCACAAGGGCGGCGCCGGTTT y R-GCGAGGCCGGGTCCAGAGCTG G. Las
amplificaciones se realizaron en un termociclador GeneAmp 9700
(Perkin Elmer) y los perfiles térmicos incluyeron una
etapa de denaturación inicial a 94°C/5 minutos,
seguido por 40 ciclos de 94°C/30 segundos, 57°C/30
segundos y 72°C/1 minuto, para terminar con una
extensión final a 72°C/5 minutos. En la segunda
reacción las condiciones fueron las mismas, excepto que la
temperatura de
annealing se aumentó a 68°C.

Análisis estadístico. Para
determinar los parámetros de sensibilidad, especificidad y
concordancia (valor kappa)
se utilizaron tablas de contingencia (2×2) empleando el programa
computacional Win Episcope 2.0. Todos los análisis se
realizaron con un nivel de confianza de 95%.

RESULTADOS

La prueba AGID identificó un menor número
de animales positivos que las pruebas de PCR
en sangre, ELISA en suero y ELISA en leche (figura 1). De 126
animales analizados, AGID detectó 75 animales positivos,
lo que equivale al 60% del total. Por otro lado, PCR
detectó un 25% más de positivos que AGID (100/126).
Tres animales positivos a AGID fueron negativos, según la
prueba PCR en sangre, y 28 de las 51 muestras negativas a AGID
fueron positivas a PCR (cuadro 1). La concordancia obtenida entre
ambas pruebas fue de 75% mientras que el valor estadístico
kappa fue de 0,45, considerándose moderado. La
sensibilidad diagnóstica de PCR con respecto a AGID fue de
96% mientras que la especificidad fue de 45%.

 El método ELISA, aplicado tanto en suero
como en leche, permitió detectar un total de 100 animales
positivos (79%), lo que equivale a un 25% más de animales
positivos que la prueba AGID (cuadro 2). Todos los animales
positivos a AGID fueron también positivos a ELISA aplicado
tanto en suero como en leche, mientras que 25 animales negativos
a AGID fueron consignados como positivos a ELISA, en ambas
muestras biológicas. De esta forma, la concordancia entre
ambas pruebas fue de 79% con un valor kappa de 0,55 y
los parámetros de sensibilidad y especificidad fueron 100
y 51%, respectivamente.

El mismo análisis se realizó considerando
a la prueba PCR en sangre como el método de referencia y
comparando a los métodos
AGID, ELISA en suero y ELISA en leche (cuadro 3). En este caso,
el valor kappa de 0,85 indica una concordancia casi
perfecta, tanto en suero como en leche, entre las pruebas de PCR
y ELISA (Landis y Koch 1977), manteniéndose la
concordancia descrita en el Cuadro 1 para PCR y AGID.

DISCUSIÓN

En este estudio se evaluó el uso de un
método de PCR anidado como prueba directa y los
métodos AGID y ELISA como pruebas indirectas para la
detección del VLB en un rebaño lechero con alta
prevalencia de la infección. De acuerdo a nuestros
resultados, el PCR en sangre y el ELISA en suero y leche
detectaron un mayor número de animales positivos (25%) que
AGID. Todas las muestras negativas a ELISA, tanto en suero como
en leche, fueron también negativas a AGID. Sin embargo,
tres muestras negativas a PCR fueron positivas a AGID y ELISA,
situación que se podría explicar por la ausencia
del VLB en linfocitos sanguíneos (Eaves y col 1994), una
infección restringida a órganos linfoides
(Klintevall y col 1994) o las variaciones de la secuencia
nucleotídica de algunos aislados del virus, que
podrían inducir a errores en la hibridación de los
oligonucleótidos utilizados como cebadores, disminuyendo
consecuentemente la sensibilidad del PCR (Marsolais y col 1994,
Fechner y col 1997). Finalmente, no podemos descartar que, a
pesar de haber utilizado una etapa de hemólisis y lavado
de eritrocitos, persistan trazas de inhibidores que afecten la
sensibilidad del PCR (Panaccio y Lew 1991).

En forma interesante, la prueba de PCR en sangre
identificó tres muestras positivas, que, sin embargo,
fueron negativas en las pruebas serológicas empleadas,
sugiriendo la presencia de animales inmunotolerantes o con baja
respuesta inmunológica al VLB en el rebaño
analizado. Para clarificar esta situación, se
re-muestrearon estos animales al año siguiente y se
repitieron los análisis con las pruebas de ELISA en suero
y PCR en sangre. Lamentablemente, uno de los animales
había sido eliminado del predio; sin embargo, los otros
dos aún permanecían por lo que fue posible repetir
el análisis. El resultado de ambas muestras (datos no
mostrados) fue similar al obtenido durante el primer
análisis, es decir, ELISA confirmó el valor
negativo obtenido anteriormente mientras que PCR confirmó
el resultado positivo en ambos animales. Este resultado confirma
los hallazgos realizados previamente por algunos autores (Fechner
y col 1997), quienes habían sugerido la presencia de
animales inmunotolerantes al VLB, observación que es siempre cuestionada al
argumentarse que se debería a una mayor sensibilidad del
PCR, lo que permitiría detectar animales infectados antes
de que estos desarrollen una respuesta inmunológica,
animales con una baja carga de exposición
del virus (Kaaden y col 1982), animales cursando un
período prolongado de latencia o a coinfecciones con otro
virus (Jacobs y col 1992). De esta forma, estos resultados
resaltan la importancia de incorporar en los programas de
control y erradicación del VLB un diagnóstico complementario del virus con
alguna técnica directa como puede ser PCR.

Cuando las pruebas de ELISA en suero, ELISA en leche y
PCR en sangre fueron comparadas con respecto a AGID, el
método oficial en Chile para el diagnóstico
serológico del VLB, la especificidad diagnóstica
obtenida fue baja (51, 51 y 45%, respectivamente). Sin embargo,
esta situación no se debe a reacciones falso positivas de
estas pruebas, sino más probablemente a la mayor
sensibilidad de las mismas respecto a AGID (Eaves y col 1994). De
la misma forma, la concordancia de las distintas pruebas
empleadas, medida por el valor kappa, se puede considerar como
moderado cuando AGID se utilizó como referencia. Estos
resultados contrastan cuando se utiliza el PCR como método
de referencia, ya que, en este caso, se obtuvo una buena
concordancia casi perfecta de esta técnica con ELISA, con
un valor kappa entre ambas pruebas de 0,85.

Nuestros resultados se comparan favorablemente con los
resultados obtenidos por Fechner y col (1996) y más
recientemente Trono y col (2001), quienes detectaron un total de
17,7 y 24,8% más de animales positivos al comparar un
método de PCR con AGID, respectivamente. Sin embargo,
contrastan con lo obtenido por Nagy y col (2003), quienes
determinaron una sensibilidad del PCR respecto a ELISA de
sólo un 67%, a diferencia de nuestros resultados, donde
PCR fue muy similar en su capacidad para detectar animales
positivos que el ELISA empleado (sensibilidad de 97%). En nuestro
caso, el mejor resultado que se obtuvo con PCR se debería
fundamentalmente a la adición, durante el proceso de
extracción de ADN, de una etapa de hemólisis de los
eritrocitos con NH4Cl, ya que está descrito el
efecto inhibidor de residuos de hemoglobina sobre la Taq
polimerasa (Panaccio y Lew 1991). Además, el PCR
desarrollado por nosotros correspondió a un PCR anidado,
lo cual aumenta la sensibilidad y especificidad del
método. Otro factor importante y que puede afectar la
correlación de ambas técnicas
tiene que ver con el recuento de linfocitos y la carga de
linfocitos infectados de los animales, aunque este dato se
desconoce en cada uno de los estudios realizados.

Una de las ventajas del PCR es su capacidad para
detectar el virus en terneros infectados que recibieron calostro
desde madres seropositivas. Además, mediante PCR se pueden
determinar infecciones recientes, entre 2-4 semanas más
temprano que mediante AGID (Naif y col 1992, Kelly y col 1993) y
puede constituir, por tanto, un gran aporte en los programas de
erradicación, especialmente en aquellos rebaños con
una baja prevalencia de animales infectados.

La prueba AGID en suero o el ELISA en suero o leche han
sido reconocidas por la
Organización Internacional de Epizootias (OIE) para el
diagnóstico del VLB (OIE 2001). Debido a la simplicidad y
sus ventajas prácticas y económicas, la prueba AGID
ha tenido una rápida incorporación como
método de diagnóstico oficial en muchos
países. Sin embargo, la baja sensibilidad demostrada por
nosotros y otros autores, sumado a la aparición de mejores
herramientas
de diagnóstico de la enfermedad, que permiten alcanzar
mayores niveles de sensibilidad y especificidad, debieran hacer
reconsiderar la utilización de esta prueba como
método de diagnóstico oficial.

En conclusión, aunque la decisión de
qué prueba utilizar para el diagnóstico del VLB va
a depender finalmente de factores tanto técnicos como
económicos, la principal conclusión es que el uso
de ELISA o PCR en lugar de AGID permite detectar un mayor
número de animales infectados por el VLB. Además,
dada la probabilidad de
encontrar animales inmunotolerantes, se recomienda utilizar una
combinación de ELISA y PCR cuando el objetivo es
erradicar la infección de un rebaño.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen el apoyo técnico brindado
por Horacio Floody y agradecen además, la
colaboración anónima y desinteresada del productor
de la IX Región que facilitó el muestreo de sus
animales.

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